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病理检查中冰冻切片冰晶多的解决方法有哪些?

作者:小编更新时间:2024-07-26

在病理学中

冰冻切片是一种常用的技术手段
用于对组织样本进行快速凝固和切割
以便进行显微镜下的观察和分析
然而有时会发现冰冻切片中出现了过多的冰晶
影响了切片的质量和解读结果
今天我们就来讲讲
病理中冰冻切片冰晶多的解决方法

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冰晶的形成

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生物体是由细胞构成的,水在各种组织细胞中含量最多。在冰冻切片中,组织中水分极易形成冰晶,因为水在结冰时因氢键的交联而膨胀,聚合形成晶体态结晶,所以标本在冷冻过程中,水分很容易形成冰晶,使切片出现大量冰晶孔隙以及大小空泡,造成冷冻假象,从而影响到酶和抗原的定位。
冰晶的大小与其生长速率成正比,而与形成速率(成核率)成反比,也就是冰晶形成的数量愈多则愈小,对组织结构影响也愈严重。有文章认为冰冻开始时,冰晶形成速率较慢,以后逐渐增加,其临界温度为-3.3℃。从- 3.0℃降至- 4.3℃之间,形成速率急剧增加,然后再减慢。因此,在制片时首先必须做到组织在极短的时间内骤冷速冻,才能保证镜下观察时没有冰晶干扰,组织结构才能清晰,细胞形态才能完好。

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图2 冷冻温度与时间的曲线对照图


细胞外冰晶和细胞内冰晶的形成从原理来解析,都是组织降温速度不够快,未能使组织快速达到玻璃态转化点以下形成玻璃态凝固。如果冷冻速度足够快,将大大减少形成冰晶,直接形成玻璃态凝固。。


秀威 冷冻包埋仪超低温快速包埋系统


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  • -80℃快速冷冻,迅速达到制冷点,有效减少冰晶产生。

    设备制冷:室温→ -50℃, 50-60分钟

    样本制冷:根据不同标本需求,10-120秒

  • 斯特林制冷技术,无需干冰、液氮、冷冻剂;
  • 面朝下包埋技术,包埋面平整减少修片;
  • 竖切(立埋)更优秀。



防止与减少冰晶的方法



取材

✔样本取材宜新鲜,尽量保持干燥

取材时组织样本保持干燥,不要接触水,必要时用PBS清洗。冷冻之前用滤纸或纱布吸去组织上多余的水分。样本尽量不要用液体浸泡,浸泡后,组织内水分会增加,容易造成冰冻后冰品形成。

✔样本组织的大小和厚度

组织的厚度决定着速冻的时间,如果太厚,会导致标本的表面还没有冷冻,而贴近速冻台的一面温度已经太冷。在不影响实验结果的前提下,标本取材尽量小一些,控制在1.5cmx15cmx0.3cm,厚度不超过4mm,这样有利于组织的快速冻结,并将组织块尽快移到冷冻头上骤冷,以缩短冷冻时间。

预冷

✔提前开机做好预冷

避免由于缓慢冷冻而产生冰品,宜提前开冰切机做好预冷。将冰冻切片机的温度降至-20℃~-25℃。一般将冷冻箱温度降至-25℃℃,冷冻头温度降至-30℃。

✔保持刀具与台面的干燥

取材时尽量保持刀具与台面的干燥,避免组织与水接触,如送检组织内含水或血性液体,应用干的纱布或滤纸把水分吸干后再行冷冻。

OCT包埋和速冻

✔单独OCT包埋剂包埋和速冻

样品托放上速冻台,加入少量OCT包埋剂,待底部变白但表面未凝固时放上组织样本,适当加盖少量包埋剂,加冷冻锤速冻组织(注意保持组织冷冻切面的水平)。这样既可以提高冷冻速度,又可以避免接触空气后产生干、湿影响。

切片

✔冰冻切片厚度适中

冰冻切片不能太薄,一般≧6um,6um的片子可以有更多的空间避免风干假象,也会减少冰晶所造成的细胞核空洞。


总之,掌握“三度”是解决冰晶问题的关键,即湿度、温度、速度


参考文献:

毛成毅,杜娟,肖华亮,李增鹏.不同组织冰冻切片体会. 2017.


(来源:微信公众号:病理海)