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各种裂解液中的破膜组分的功能

作者： 小布丁大更新时间：2024-07-26

各种裂解液中的破膜组分主要用于细胞裂解，以便释放细胞内部的蛋白质、核酸和其他生物分子。细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性 

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关于去垢剂 (detergents)：

几种组织/细胞裂解液裂解强度(应用)的差异主要还是配方中去污剂种类和浓度的不同。去污剂分为变性去污剂(denaturing detergents)和非变性去污剂(non-denaturing detergents)，前者可以是阴离子，比如SDS；或阳离子，比如乙基三甲基溴化铵。这些去垢剂总体来说破坏膜和通过打破蛋白-蛋白间相互作用来变性蛋自；非变性去垢剂分为非离子，比如Titon X-100；胆盐，比如胆酸盐类；和两性离子去垢剂，比如CHAPS。

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不同类型的裂解液和其破膜组分具有不同的功能和特点：


1. 非离子型和两性离子型去污剂（如Triton X-100, Tween 20, NP-40）
• 破坏细胞膜的脂质双层，但通常不会破坏细胞器膜。
• 保留蛋白质的天然构象，适合用于需要保留蛋白质活性的实验，如免疫沉淀和酶活性测定。


例如，在免疫沉淀或ELISA实验中，Tween 20常用于洗脱非特异性结合的蛋白质，以减少背景信号，提高实验的特异性和灵敏度。在蛋白质提取和纯化过程中，可以防止蛋白质的非特异性吸附和变性，帮助保持蛋白质的稳定性。CHAPS常用于保持蛋白质活性和结构的同时破裂膜结构，适用于功能分析。Digitonin作为一种温和的去污剂，可以选择性地溶解包含胆固醇的膜，如细胞膜和线粒体外膜，但对线粒体内膜影响较小。这使得它特别适合用于区分和分离线粒体外膜和内膜。常用于选择性地提取线粒体外膜，同时保持内膜的完整性。相比于其他去污剂，Digitonin的作用较为温和，能够在保持蛋白质活性的同时提取膜蛋白，这对于需要保留蛋白质功能的实验非常重要。NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。 

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，溶解脂质，增加细胞膜的通透性，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。但是去垢剂属性只是一方面，buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素。


2. 阴离子型去污剂（如SDS, Deoxycholate）：

• 能有效溶解细胞膜及蛋白质，常用于彻底裂解细胞，提取总蛋白质。
• 会使蛋白质变性，适合用于SDS-PAGE和Western Blot等实验。

例如，去氧胆酸钠能有效地破坏细胞膜和核膜，广泛用于总蛋白质提取。在裂解细胞和组织时，它能够帮助溶解细胞膜中的脂质成分，释放细胞内容物。因此，常用于溶解和提取膜蛋白。相比于非离子型去污剂，它能够更加彻底地溶解难以提取的膜蛋白。

SDS属于阴离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。 

去氧胆酸钠有时与其他去污剂（如SDS）联合使用，以增强去污和蛋白质溶解效果。在某些情况下，与非离子型去污剂（如Triton X-100）联合使用，可以兼顾蛋白质溶解和活性保持。


常见的细胞裂解液成分：

50mM Tris-HCl pH7.4        (缓冲体系)

150mM NaCl                     (等渗体系)

1mM PMSF                        (蛋白酶抑制剂)

1mM EDTA                         (变性剂和稳定剂)

5μg/ml Aprotinin                (蛋白酶抑制剂)

5μg/ml Leupeptin               (蛋白酶抑制剂)

1% Triton X-100                 (弱变性剂)

0.1% SDS                           (强变性剂和溶解剂)

1% Sodium deoxycholate   (中度变性剂和溶解剂)


一些常用裂解液的主要特点和差异：

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  • 用于普通的Western、IP或co-IP，通常使用Western及IP细胞裂解液。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。

  • 对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。

  • 对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。

  • 用于特定用途需要自行添加特定抑制剂或不需要添加抑制剂时，可以考虑最后两种。用Western及IP细胞裂解液（无抑制剂）在很多时候可以兼容酶活性和生物小分子的检测，对于特定的酶或生物小分子的检测是否兼容需要自行测试。Western及IP细胞裂解液（无抑制剂）的裂解能力比RIPA裂解液（强，无抑制剂）弱一些，但用于酶活性和生物小分子时，兼容性通常会更好一些。

蛋白酶抑制剂：抑制蛋白酶的活性，避免蛋白过度降解。

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磷酸酶抑制剂：抑制去磷酸化作用

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3. 裂解酶（如Lysozyme, Trypsin）：
• 针对特定类型的细胞，如细菌细胞，能够降解细胞壁成分，使细胞膜易于裂解。
• 常与其他裂解剂联合使用，增强裂解效果。

4. 机械破碎法（如超声波裂解、玻璃珠研磨）：
• 不依赖化学裂解液，适用于坚硬的细胞壁（如酵母和植物细胞）。
• 可通过控制处理强度和时间调节裂解效果。

5. 高渗或低渗裂解（如低盐缓冲液）：
• 利用渗透压差导致细胞胀裂或收缩破裂，适合裂解脆弱的细胞类型。
• 通常配合其他裂解方法使用，以提高效率。

6. 有机溶剂（如乙醇、乙酸乙酯）：
• 能溶解脂质膜，但可能对蛋白质有较大破坏作用。
• 适用于某些特定实验，如脂质分析。

选择合适的裂解液及其破膜组分，取决于具体的实验目的和细胞类型。确保实验条件不会破坏目标分子的活性或结构，是进行成功实验的关键。



1.细胞裂解液影响细胞膜和核膜的破坏效率， 所以应根据目标分子在细胞内的定位选择裂解液。此外，不同的细胞和组织具有不同的膜组成和结构，需要针对其特性选择特定裂解液。使用错误的细胞裂解液可能导致细胞裂解不完全，进而影响数据的准确性。

2.适当的裂解液对于维持细胞内目标分子的稳定性和完整性至关重要。例如，在核酸研究中，裂解液会影响RNA、DNA及其修饰的完整性。在蛋白质组学中，它影响蛋白质和翻译后修饰的稳定性。使用错误的缓冲液可能导致这些分子的降解或变性，从而损害下游分析的准确性。

3.细胞裂解液对试验结果的一致性有重要的影响。不同的缓冲液pH值、离子强度和去垢剂不同，这些因素可能影响酶、蛋白质和其他细胞组分的结构和活性。保持缓冲液一致性对于确保实验的可重复性至关重要。

4.选择错误的裂解液会造成样品中无目的蛋白情况，例如目的蛋白为核蛋白时请勿使用NP40这类温和的裂解液。

5. 如果是分泌型蛋白，例如细胞因子或趋化因子等，组织或者细胞的裂解液可能并不能直接反映目的蛋白的表达水平，一方面可以通过刺激处理促进其胞内表达，另一方面可以尝试ELISA或者Luminex多因子检测等实验方法对细胞上清液或者生物体液等进行检测。此外，样本收集及保存过程中，需要考虑目的蛋白降解的风险，建议使用新鲜的裂解液对新鲜收集的样本进行蛋白提取，并确保裂解液中蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂活性，防止蛋白降解。样本尽量低温保存，并避免反复冻融。


（来源 微信公众号：“科研这点事儿”）



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